復(fù)蘇步驟

一.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

將水浴鍋預(yù)熱至37℃。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭并且使用紫外線(xiàn)照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等。

二．取出凍存管：

根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

三．迅速解凍：

迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四.平衡離心：

用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中1000r/min，離心5min。

五.制備細(xì)胞懸液：

吸棄上清液。

向離心管內(nèi)加入10ml預(yù)熱的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細(xì)胞：

將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

八. 記錄復(fù)蘇日期：

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面容易出問(wèn)題的部分，因此必須注意以下幾點(diǎn)~

注意無(wú)菌操作。

取細(xì)胞的過(guò)程中可能會(huì)接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。

此項(xiàng)尤為重要，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套，復(fù)蘇過(guò)程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。

應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會(huì)造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作Hao在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性。

細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中，升溫的速率要大，把從液氮取出的細(xì)胞在短的時(shí)間內(nèi)放入水浴鍋。

離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15ml培養(yǎng)液，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過(guò)多，細(xì)胞濃度過(guò)低，不利于細(xì)胞的貼壁。

加培養(yǎng)基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒(méi)有什么影響。還有一個(gè)說(shuō)法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。    

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。

水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

一次復(fù)蘇細(xì)胞種類(lèi)過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

 解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長(zhǎng)環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡，像水土不服一樣。

結(jié)果分析：

判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說(shuō)明細(xì)胞復(fù)蘇的過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長(zhǎng)，達(dá)到正常的生長(zhǎng)特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。