人的總金屬蛋白酶 1 定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的 MMP-1 濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

MMP-1 簡介： 

MMPs蛋白是一組具有鋅指結(jié)構(gòu)的鈣依賴的能夠降解胞間基質(zhì)成分的一組蛋白的統(tǒng)稱。MMP-1是該家族中重要的一員。

人的MMP1，也稱間質(zhì)膠原酶，是由成纖維細胞、角蛋白細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞和巨噬細胞等分泌的一種酶，能降解包括I、II、III、

VII和X型膠原，甚至包括酪蛋白、明膠、抗胰蛋白酶等各種蛋白。

成熟的MMP1由370個氨基酸構(gòu)成，由前體酶經(jīng)裂解形成活性形式。MMP1的抑制物包括TIMP-1和TIMP-2，α2巨球蛋白能迅速抑制

MMP-1的活性，除此之外，菲啰啉和EDTA等金屬螯合劑也能抑制MMP－1的活性。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中MMP-1 的濃度。MMP-1捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的MMP-1會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人MMP-1抗體后，抗人MMP-1抗體與MMP-1 接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在MMP-1 將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，MMP-1濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中MMP-1 濃度。

人MMP-1定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成: 

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可，不能檢測RPMI培養(yǎng)基上清； B.血清標本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C. 血漿標本，不能用EDTA和檸檬酸抗凝管收集；

D. 若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。2.血清標本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3. 標本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4. 請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注意事項:

1. 試劑盒請保存在2～8℃。

2. 濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3. 標準品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4. 底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5. 加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6. 嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7. 充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8. 室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃。

9. 洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10. 試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11. 加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12. 血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當延長。

檢測前準備工作:  

1. 試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25～28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3. 將5×標準品稀釋液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水)。

4. 標準品: 按標簽復(fù)溶體積加入1X標準品稀釋液復(fù)溶使MMP-1終濃度達到10000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20 分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為10000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料： 

1. 不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；

2. 酶標儀；

3. 自動洗板機；

4. 去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1. 通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2. 建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3. 分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育 120 分鐘。如果是血清血漿樣本， 不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在 4~20 倍，如無明確范圍，建議從 5 倍開始，加樣稀釋說明如下：每孔先加樣本分析緩沖液 50ul，

再加用 1×標準品稀釋液稀釋 2.5 倍后的樣本，加樣量為 50ul。4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5. 加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育60分鐘。

6. 洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7. 加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫(25～28℃)孵育20分鐘。

8. 洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9. 加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫(25～28℃)孵育20分鐘。

10. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1. 復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2. 每個標準品或標本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3. 手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4. 若標本 OD 值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人MMP-1參考標準曲線