小鼠IL-18定量分析酶聯(lián)免疫

檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的IL-1O濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質量投拆，請在收到貨一個月之內聯(lián)系我們。

IL-18簡介：

白介18（IL-18）是一個18 kDa的細胞因子，結構上與IL-1極其相似，對T細胞的活化有重要影響。IL-18的前體缺少信號肽，前體由IL-1beta轉換酶（ICE）裂解為成熟的IL-18。

有報道稱IL-18由下列細胞產(chǎn)生：樹突狀細胞、活化的巨噬細胞、凱夫勒細胞、角化細胞、腸內皮細胞、格根包爾氏細胞、腎上腺皮質細胞等。其中有報道稱人的角化細胞是IL-18的主要產(chǎn)生源。

IL-18對T輔助細胞起作用，其效果是與IL-12協(xié)同強烈刺激T輔助細胞產(chǎn)生IFN-γ。當然，IL-18也有許多其它的效用，包括刺激外周血中由單核細胞產(chǎn)生IFN-γ 和 GM-CSF水平的升高，刺激T細胞產(chǎn)生Th1類的細胞因子如IL-2、IFN-γ 和GM-CSF等，提高Th1類的細胞表面的Fas配體的表達。此外，在治療腫瘤、感染和自身免疫方面，IL-18也是一個重要的預后指標。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-18的濃度。IL-18捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的IL-18會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IL-18抗體后，抗小鼠IL-18抗體與小鼠IL-18接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在小鼠IL-18蛋白將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，小鼠IL-18濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中小鼠IL-18濃度。

小鼠IL-18定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測，

D.標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注:樣本如需稀釋請用標準品稀釋液稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶，請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

樣本的稀釋:

1. 血清或血漿樣本5~30倍稀釋，不同樣本含量不一樣，檢測前需預實驗，如無明確范圍，可從5倍開始。

2.細胞上清及尿樣本稀釋倍數(shù)根據(jù)預實驗確定；

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.將5×標準品稀釋液用去離子水或雙蒸水按1:4稀釋成所需的體積；

4.將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鐘配制成工作濃度；

5.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使IL-18終濃度達到1500pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為100ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）下圖為標準品稀釋示意圖。

洗滌方法:

自動洗板機或小鼠工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。    

4.洗板3次（重要提示，一定是三次），且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板3次（重要提示，一定是三次），且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7. 加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)

典型數(shù)值和參考曲線

小鼠IL-18參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結果表明，最小檢出量為16.8ng/ml。

2.特異性：與小鼠的IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 p70, IL-13, IL-17及人IL-18等沒有交叉反應。

3.重復性：板內，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

1. Lalor, S.J. et al. (2011) J. Immunol. 186:5738.

2. Gu, Y. et al. (1997) Science 275:206.

3. Fehniger, T.A. et al. (1999) J. Immunol. 162:4511.

4. Smith, D.E. (2011) J. Leukoc. Biol. 89:383.

5. Elbim, C. et al. (2005) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:436.

6. Yoshimoto, T. et al. (2000) Nat. Immunol. 1:132.

7. Kroeger, K.M. et al. (2009) J. Leukoc. Biol. 86:769.