小鼠血管細胞粘附蛋白1定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的VCAM-1濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

VCAM-1 簡介：

血管細胞粘附蛋白1（VCAM1），也叫CD106，屬于免疫球蛋白家族的粘附分子。VCAM1是715個氨基酸構(gòu)成的I型跨膜糖蛋白，胞外部分674個氨基酸，跨膜部分22個氨基酸，胞內(nèi)有19個氨基酸的“尾巴”。根據(jù)不同種裂解方式，VCAM1胞外部分有6個Ig樣結(jié)構(gòu)域和7個Ig樣結(jié)構(gòu)域的兩個類型。VCAM1 可以在不同種類細胞表面表達，這些種類的細胞包括活化的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、神經(jīng)元細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和卵母細胞等。

VCAM1與整合素α4β1 (VLA4) 和α4β7結(jié)合，從而發(fā)揮許多功能。這此功能包括VCAM1在白細胞的遷移、白細胞粘附內(nèi)皮細胞、信號傳導(dǎo)等生理過程中起作用。VCAM1在沉滯性動脈硬化癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中都起作用。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中VCAM-1的濃度。VCAM-1捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當(dāng)加入標本或參考品時，其中的VCAM-1會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗小鼠VCAM-1抗體后，抗小鼠VCAM-1抗體與VCAM-1接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在VCAM-1將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，VCAM-1濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中VCAM-1濃度。

小鼠VCAM-1定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X標準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標準品: 按標簽復(fù)溶體積加入1X標準品稀釋液復(fù)溶使VCAM-1終濃度達到8000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為8000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或小鼠工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3. 分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育120分鐘。如果是血清血漿樣本，不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在血清血漿樣本稀釋1000~15000倍，如無明確范圍，建議從1000倍開始稀釋，如果樣本濃度過高，超過檢測范圍，請加大稀釋倍數(shù)后重新稀釋檢測。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

小鼠VCAM-1參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為45.8pg/ml

2.特異性：與小鼠的E-Selectin、ICAM-1、L-Selectin、P-Selectin及人VCAM-1沒有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%

參考文獻:

1. Feuerbach, D. and J.H.M. Feyen (1997) FEBS Lett. 402:21.

2. Moy, P. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:8835.

3. Steffen, B.J. et al. (1996) Am. J. Pathol. 148:1819.

4. Terry, R.W. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5919.

5. Simmons, P.J. et al. (1997) Baillieres Clin. Haematol. 10:485.