小鼠胰島素定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的胰島素濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

胰島素簡介：

胰島素是糖代謝中最主要的激素之一。胰腺的?細胞島細胞產(chǎn)生胰島素前體蛋白，前體蛋白被加工成C肽和胰島素。它們以等摩爾濃度進入血循環(huán)中。成熟的胰島素由A、B兩條鏈組成。這兩條鏈是通過兩個二硫鍵橋接形成有功能的胰島素分子。

血漿葡萄糖濃度的變化是胰島素產(chǎn)生并分泌的最主要刺激因素，產(chǎn)生的胰島素具有一些代謝調(diào)節(jié)作用。其最主要的作用是，將外周血中糖轉(zhuǎn)運到肝臟中貯存起來。一些諸如肝糖生成障礙或在促進血糖升高的激素諸如胰高血糖素、腎上腺素、生長激素和皮質(zhì)醇等作用下促進肝糖分解都可拮抗胰島素的作用。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中胰島素的濃度。胰島素捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當同時加入標本或參考品和HRP耦連的抗小鼠胰島素抗體時，其中胰島素的不同位點會與捕獲抗體和HRP耦連的抗小鼠胰島素抗體結(jié)合，形成夾心復(fù)合物，錨定在固相載體板上，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在胰島素將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，胰島素濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中胰島素濃度。

小鼠胰島素定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測，

D.標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復(fù)溶加樣后，剩余部分請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當延長。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X標準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標準品: 按標簽復(fù)溶體積加入標準品稀釋液復(fù)溶使胰島素終濃度達到5.5ng/ml，室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為5.5ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；      

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                        

4.去離子水或雙蒸水；         

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(10ul/孔)加入相應(yīng)孔中，快速加入小鼠胰島素抗體HRP結(jié)合物(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

6.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

小鼠胰島素參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為0.1ng/ml。

2.特異性：不與IGF-I、IGF-II、 小鼠 C肽、大鼠 C肽反應(yīng)，與豬胰島素、綿羊胰島素、大鼠胰島素、牛胰島素及人胰島素分別有628%，256%，146%，110%和195%交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

Korner J, Savontaus E, Chua SC, Jr., Leibel RL, Wardlaw SL (2001) Leptin regulation of Agrp and Npy mRNA in the mousehypothalamus. J Neuroendocrinol 13:959-966

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