小鼠瘦素定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測(cè)小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Leptin濃度。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請(qǐng)?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

Leptin簡(jiǎn)介：

小鼠瘦素蛋白是一個(gè)146個(gè)氨基酸的多肽激素，主要由脂肪細(xì)胞釋放，其主要作用是調(diào)控食欲的降低和能量消耗。但是，人們還發(fā)現(xiàn)瘦素蛋白在血管再生、骨代謝、造血及免疫調(diào)節(jié)上有重要的作用。瘦素可與丘腦下部的中央脊腹部的飽覺(jué)中樞結(jié)合，從而使得大腦得到食物充足的信號(hào)，這樣瘦素的表達(dá)水平的高低就可達(dá)到調(diào)控能量攝入和機(jī)體的能量消耗作用。瘦素功能的實(shí)現(xiàn)主要跟瘦素受體結(jié)合后實(shí)現(xiàn)的，瘦素受體有兩類，一類是固定細(xì)胞膜上的受體，主要通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路起作用，另一類是游離的受體，這類受體一般是丟失了受體的細(xì)胞膜內(nèi)的部分，游離出來(lái)的，根據(jù)失去的結(jié)構(gòu)不同，游離受體的種類較多。人體內(nèi)游離的受體的產(chǎn)生主要是由金屬蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞膜外功能域的脫落后形成的。

檢測(cè)原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中小鼠Leptin 的濃度。小鼠Leptin 捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的小鼠Leptin 會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗小鼠Leptin 抗體后，抗小鼠Leptin 抗體與小鼠Leptin 接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)；其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在小鼠Leptin 將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的OD值，Leptin 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中Leptin 濃度。

小鼠Leptin定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測(cè)樣本不能及時(shí)檢測(cè)，標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測(cè)前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過(guò)離心去除。

4.請(qǐng)勿使用溶血高血脂或污染的標(biāo)本檢測(cè)，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：小鼠血清或血漿樣本請(qǐng)使用樣本分析緩沖液。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒請(qǐng)保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請(qǐng)丟棄。

4.底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過(guò)程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過(guò)程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測(cè)后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，請(qǐng)按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使小鼠leptin終濃度達(dá)到8000pg/ml，室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為8000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動(dòng)洗板機(jī)；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過(guò)計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。如果是血清血漿樣本，不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在1.25~10倍，如無(wú)明確范圍，建議從2倍開(kāi)始，加樣稀釋說(shuō)明如下：每孔先加樣本分析緩沖液50ul，再加用1×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后的樣本，加樣量為50ul。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測(cè)量值。

2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù).

典型數(shù)值和參考曲線

小鼠Leptin參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為134.6pg/ml。

2.特異性：與人G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6等沒(méi)有交叉反應(yīng)。與大鼠lepin有40%交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

1. Masuzaki, H. et al. 1997 J. Clin. Endocrin. and Metabolism 82:2542.

2. Coleman, D.L. (1978) Diabetologia 14:141.

3. Houseknecht, K.L. et al. (1996) Diabetes 45:638.

4. Chen, H. et al. (1996) Cell 84:491.

5. Pagano, C. et al. (1997) Int. J. Obesity 21:614.

6. Lee, G.H. et al. (1996) Nature 379:632.