小鼠總免疫球蛋白G(IgG）定量

分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分是否完整, 本試劑盒僅供科研使用。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請(qǐng)?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

1.IgG簡(jiǎn)介

免疫球蛋白G（IgG）主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，以單體形式存在。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中機(jī)體在出生后第3個(gè)月開(kāi)始合成IgG，3～5歲接近成年人水平。IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清總Ig的75%。

免疫球蛋白G在免疫應(yīng)答中起著激活補(bǔ)體，中和多種毒素的作用，是機(jī)體抗感染的主要物質(zhì)。

IgG是四鏈單體，根據(jù)IgG分子中γ鏈抗原性差異，人IgG有4個(gè)亞類(lèi)：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4（小鼠4個(gè)亞類(lèi)是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）。不同IgG亞類(lèi)的生物學(xué)活性有所差異。IgG的半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，約為20～30天。

2.檢測(cè)原理

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)小鼠來(lái)源樣本中的總IgG濃度。IgG捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的IgG會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。當(dāng)加入與HRP耦連的抗IgG抗體后，抗小鼠IgG抗體與IgG接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IgG將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的OD值，IgG濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IgG濃度。

3.試劑盒組成

3.1、預(yù)包被板12條/6條(96T/48T)；

3.2、標(biāo)準(zhǔn)品2瓶/1瓶(96T/48T)，凍干；  

3.3、20×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，1瓶10ml/5ml(96T/48T)；

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中0濃度標(biāo)準(zhǔn)品以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入。

3.4、即用型抗IgG抗體的HRP酶結(jié)合物1瓶， 5ml/2.5ml（96T/48T）

3.5、TMB底物溶液，1瓶10ml/5ml（96T/48T）；

3.6、中止液，1瓶5ml；

3.7、濃縮洗滌液（20×），1瓶30ml/15ml（96T/48T）；

3.8、封板紙3張/2張（96T/48T）；

3.9、說(shuō)明書(shū)一份；

4.檢測(cè)中需要但沒(méi)有提供而需要自備的材料：

4.1、振蕩混勻器。

4.2、可控溫水浴箱  37℃。

4.3、ELISA酶標(biāo)儀（450nm）。

4.4、移液槍頭等         

5．注意事項(xiàng)

5.1、未開(kāi)封的試劑應(yīng)保存在2－8℃。

包裝箔袋開(kāi)封后，應(yīng)立即封緊。開(kāi)封后的包被微孔板儲(chǔ)存在2－8℃下可以穩(wěn)定6個(gè)星期。

5.2、所有試劑和所需的微孔板條在使用前應(yīng)平衡至室溫。

5.3、使用前將濃縮洗滌液用蒸餾水按1：20稀釋?zhuān)ɡ纾?0ml濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水稀釋至終體積200ml）。

5.4、稀釋后的洗滌液在2－8℃下可以保存4個(gè)星期。

5.5、樣本收集

血清和EDTA處理的血漿樣本。避免使用明顯溶血、黃疸、脂血樣本。使用的血清和EDTA血漿樣本，按常規(guī)方法制備。樣品在2－8℃下保存不超過(guò)24小時(shí)。如果樣品需要長(zhǎng)期存放（3個(gè)月以上），應(yīng)凍存在－20℃。使用過(guò)程中應(yīng)避免反復(fù)凍融。

6.檢測(cè)過(guò)程

所有的試劑和樣本在使用前應(yīng)平衡至室溫并搖勻（搖勻過(guò)程應(yīng)保證無(wú)泡沫產(chǎn)生）。一旦檢測(cè)開(kāi)始，應(yīng)連續(xù)操作，不中斷。開(kāi)始分析前，推薦準(zhǔn)備好所有試劑，打開(kāi)瓶蓋，將所需微孔板條固定等等，以防止實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)不必要的時(shí)間拖延。使用每種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，都應(yīng)更換一次性移液槍頭，以免交叉污染。

7.檢測(cè)步驟

7.1、將所需微孔板條在微孔架上固定，按1份標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加19份超純水或去離子水提前稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的工作原理；

7.2、移取10μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本至相應(yīng)微孔中，樣本需稀釋100000倍以上。

提前稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100μl至凍干標(biāo)準(zhǔn)品瓶中使IgG終濃度達(dá)到100ng/ml，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為100ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

7.3、 每孔加90μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，25～28℃孵育120分鐘；

7.4、 用洗滌液將微孔洗滌5次（推薦使用洗板機(jī)）。

重要提示：

洗滌液加入板孔中，需浸泡10秒，最后一次必須在干凈的吸水紙上用力拍打微孔，除去殘留洗滌液。洗滌操作的正確與否將影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)分析的靈敏度和精密度。

7.5、每孔加50μlHRP耦連的抗IgG抗體，，25～28℃孵育60分鐘；

7.6、用洗滌液將微孔洗滌5次（推薦使用洗板機(jī)）。

7.7、每孔加入100ul底物溶液。室溫避光孵育15分鐘（25－28℃）。

7.8、每孔加入50ul終止液，終止酶反應(yīng)。并在450nm處測(cè)定OD值（參考波長(zhǎng)600－650nm）。讀取OD值最好在10分鐘內(nèi)完成。

8．結(jié)果計(jì)算

在方格座標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)刻度），對(duì)應(yīng)的OD值作為縱坐標(biāo)（線(xiàn)性刻度）。利用連接的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可讀出樣本的OD值對(duì)應(yīng)的濃度值。試劑濃度需乘以稀釋倍數(shù)。

任何樣品濃度如果高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度，樣品應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作適當(dāng)稀釋后重新測(cè)量分析。所得結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)后即樣品實(shí)際濃度。

9.參考數(shù)據(jù)及曲線(xiàn)

                  典型參考數(shù)據(jù)

小鼠IgG參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

10．靈敏度、特異性和重復(fù)性

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為1.24ng/ml。

2.特異性：本試劑盒采用特異性抗體識(shí)別小鼠IgG，包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，檢測(cè)值為總的IgG濃度。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.