大鼠細(xì)胞間粘附分子1定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測大鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ICAM-1濃度。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整,如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

ICAM-1簡介

細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)是一個屬于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白。成熟的ICAM-1由27個氨基酸信號肽結(jié)構(gòu)，466個氨基酸細(xì)胞外區(qū)域結(jié)構(gòu)，25個氨基酸的跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)，27個氨基酸的胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)共545個氨基酸構(gòu)成的分子。一般說來，ICAM-1在膜上以二聚體形式存在。溶解的ICAM-1有493個氨基酸殘基，分子量為78kDa，因為是個糖蛋白，分子質(zhì)量在110-125KDa之間。

ICAM-1在平滑肌細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、支氣管內(nèi)皮細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都有表達(dá)，ICAM-1的表達(dá)受炎性細(xì)胞因子的調(diào)控。

ICAM-1的基本功能是在受傷后或壓力狀態(tài)下，使得內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞粘附。ICAM-1能與白細(xì)胞功能抗原(LFA-1)或巨噬細(xì)胞1抗原(Mac-1)結(jié)合而起作用。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中大鼠ICAM-1的濃度。大鼠ICAM-1捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時，其中的大鼠ICAM-1會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗大鼠ICAM-1抗體后，抗大鼠ICAM-1抗體與大鼠ICAM-1接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在ICAM-1將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測，讀其450nm處的OD值，大鼠ICAM-1濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中ICAM-1濃度。

大鼠ICAM-1定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請按下列流程進行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時檢測，標(biāo)本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：大鼠血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準(zhǔn)備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25～28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X準(zhǔn)品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使ICAM終濃度達(dá)到4000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個點，最高濃度為4000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動洗板機；                    

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標(biāo)準(zhǔn)品對照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育120分鐘。對于血清或血漿標(biāo)本，請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本，如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補充至100ul。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素鏈接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫(25～28℃)孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫(25～28℃)孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

大鼠ICAM-1參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為14pg/ml。

2.特異性：與GDNF, GM-CSF,TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-4 ,PDGF-BB, IL-10,人 ICAM,小鼠ICAM

等沒有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

1. Reilly, P.L. et al. (1995) J. Immunol. 155:529.

2. Jun, C-D. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:29019.

3. Miller, J. et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1231.

4. Stocker, C. et al. (2000) Transplantation 70:579.

5. Porter, J.C. et al. (2002) J. Immunol. 168:6330.

6. Chirathaworn, C. et al. (2002) J. Immunol. 168:5530.

7. Ballantyne, C. M.; Kozak, C. A.; O'Brien, W. E.; Beaudet, A. L. Assignment of the gene for intercellular adhesion molecule-1 (Icam-1) to proximal mouse chromosome 9. Genomics 9: 547-550, 1991.

8. Bella, J.; Kolatkar, P. R.; Marlor, C. W.; Greve, J. M.; Rossmann, M. G. The structure of the two aminoterminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand. Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 4140-4145, 1998.

9. Simmons, D.; Makgoba, M. W.; Seed, B. ICAM, an adhesion ligand of LFA-1, is homologous to theneural cell adhesion molecule NCAM. Nature 331: 624-627, 1988.