人自然殺傷細(xì)胞刺激因子定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-12P70濃度。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請(qǐng)?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

IL-12P70簡(jiǎn)介：

IL-12P70也稱(chēng)為自然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF)主要是由受激發(fā)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子。IL-12P70還可由樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和角化細(xì)胞等產(chǎn)生。

具生物學(xué)活性的人IL-12P70是二硫鍵連接一個(gè)40 kDa (p40)和35 kDa (p35)的亞基的異型復(fù)合體，即70 kDa (p70)。成熟的人40 kDa (p40)亞基有13個(gè)半胱氨酸和5個(gè)可糖基化的N末端的N313個(gè)氨基酸的蛋白。無(wú)論是p40 還是 p35亞基都不具有IL－12的生物學(xué)活性，但由兩個(gè)p40亞基構(gòu)成的同型復(fù)合物可與IL-12P70受體結(jié)合，從而充當(dāng)IL-12P70的拮抗劑。雖然小鼠的IL-12P70對(duì)人和小鼠細(xì)胞都有活性，但人的IL-12P70只對(duì)人細(xì)胞有生物活性。

IL-12P70對(duì)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞有多種作用，這些作用包括在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中誘導(dǎo)干擾素和腫瘤壞死因子的生產(chǎn)，提高T細(xì)胞和NK細(xì)胞毒素的活性的以及刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞的分化。IL-12P70是IFN-γ的強(qiáng)烈誘導(dǎo)物，但誘導(dǎo)出的IFN-γ反過(guò)刺激吞噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12P70和其它促炎性因子，這樣，由IL-12P70誘導(dǎo)的IFN-γ就在感染時(shí)促炎癥反應(yīng)中反饋放大的機(jī)理中扮演重要的角色。IL-12P70 在通過(guò)提高Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中有重要作用。

檢測(cè)原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中IL-12P70的濃度。IL-12P70捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的IL-12P70 會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人IL-12P70 抗體后，抗人IL-12P70 抗體與IL-12P70 接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)；其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-12P70 將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的OD值，IL-12P70 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IL-12P70 濃度。

人IL-12P70定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測(cè)樣本不能及時(shí)檢測(cè)，標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測(cè)前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過(guò)離心去除。

4.請(qǐng)勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測(cè)，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：人血清或血漿樣本請(qǐng)用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測(cè)。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒請(qǐng)保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請(qǐng)丟棄。

4.底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過(guò)程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過(guò)程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測(cè)后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，請(qǐng)按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋備用。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使IL-12P70終濃度達(dá)到1000pg/ml，室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為1000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動(dòng)洗板機(jī)；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過(guò)計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。對(duì)于血清或血漿標(biāo)本，請(qǐng)加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本，如稀釋量大，請(qǐng)將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測(cè)量值。

2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人IL-12P70參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為5.8pg/ml。

2.特異性：與人的G-CSF、IL-6、IL-12/IL-23 p40及小鼠IL-12 p70、IL-12/IL-23 p40無(wú)交叉反應(yīng)性。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

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3. Shortman, K. and W. Heath (2010) Immunol. Rev. 234:18.

4. Gearing, D.P. and D. Cosman (1991) Cell 66:9.

5. Khalife, J. et al. (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:69.

6. Kang, K. et al. (1996) J. Immunol. 156:1402.

ELISA Kit for the Quantitative Analysis of Human IL-12P70

The human IL-12P70 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit is used for detection of human IL-12P70 in cell culture supernatants,human serum and plasma.THE ELISA KIT IS FOR RESEARCH USE ONLY. Please read this instruction manual carefully and check out the material provided before use, and you can contact with our company if any questions. You can enter our website or call us for other aim.

Introduction

IL-12P70 pleiotropic cytokine, formerly termed cytotoxic lymphocyte maturation factor (CLMF) or natural killer cell stimulatory factor (NKSF), which is produced primarily by stimulated macrophages. IL-12P70 may be produced by cells include dendritic cells, monocytes , Langerhans cells, neutrophils, and keratinocytes.Biologically.

Active human IL-12P70 is a disulfide-linked, 70 kDa (p70) heterodimeric glycoprotein composed of a 40 kDa (p40) subunit and a 35 kDa (p35) subunit. Mature human p40 subunit has 313 aa, with 13 cysteines and five potential N-linked glycosylation sites. Both p40 and p35 subunits have not activity same with IL-12P70, While the p40 homodimer has been shown to bind the IL-12P70 receptor and is an IL-12P70 antagonist .Although mouse IL-12P70 is active on both human and mouse cells, human IL-12P70 is only active on human cells.

IL-12P70 exerts a variety of biological effects on T and natural killer cells. Some of these effects include the induction of IFN-γ and TNF-α production by T and NK cells, the enhancement of cytotoxic activity of T and NK cells and the stimulation of T and NK cell proliferation. As a potent inducer of interferon gamma (IFNγ) production, the IFNγ then enhances the ability of the phagocytic cells to produce IL-12P70 and other proinflammatory cytokines. Thus, IL-12P70 induced IFNγ acts in a positive feedback loop that represents an important amplifying mechanism in the inflammatory response to infections. IL-12P70 has also been shown to be a central mediator of the cell-mediated immune response by promoting Th1 development .

Principles of the Test

The kits is a solid sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of human IL-12P70. An anti-human IL-12P70 monoclonal antibody has been absorbed onto the wells of the microtiter strips provided. Samples including specimens or standards were pipetted into wells. The human IL-12P70 in specimens or standards would be captured by the coated antibody and the free others were removed by washing. The human IL-12P70 biotin-conjugated antibody were added and binds to human IL-12P70 captured by the first antibody, which formed a sandwich. Streptavidin-HRP would be added and binds to the biotin conjugated antibody, then free Streptavidin-HRP would be removed during a wash step. After this, subtrate solution would be added and catalyzed by the HRP, and a coloured product is formed. The intensity of the colored product is used to calculate in proportion to the amount of human IL-12P70 in the original specimen.  

Materials provided with the kits:

reagent	96/48Test Kit
Assay Buffer	5ml/3 ml
Human IL-12P70 Antibody-Coated Wells	12 strips/6 strips
相關(guān)產(chǎn)品 貨號(hào) 產(chǎn)品名稱(chēng) 規(guī)格 價(jià)格 指令 HH-09 人白細(xì)胞介素12P70 ELISA試劑盒 Human IL-12P70 ELISA KIT 96T/48T ￥2800.00/1760.00.00 放入購(gòu)物車(chē) 》 HH-24 人白細(xì)胞介素22ELISA試劑盒Human IL-22 ELISA KIT 96T ￥3800.00 放入購(gòu)物車(chē) 》 HH-01 人白細(xì)胞介素1α ELISA試劑盒 Human IL-1αELISA KIT 96T/48T ￥2800.00/1760.00.00 放入購(gòu)物車(chē) 》 HH-02 人白細(xì)胞介素1β Human IL-1β ELISA KIT 96T/48T ￥2800.00/1760.00.00 放入購(gòu)物車(chē) 》 公司簡(jiǎn)介 / Company profile 上海傳秋生物科技有限公司 Shanghai Chuan Qiu Biotechnology Co.,Ltd.        公司主要依托復(fù)旦大學(xué)、同濟(jì)大學(xué)等上海地區(qū)多家著名高校，擁有一支富有經(jīng)驗(yàn)的開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)，專(zhuān)業(yè)從事細(xì)胞及細(xì)胞... 聯(lián)系我們 / Contact 電　話(huà)：021-69950217  173-2144-0983 傳　真：021-69950218 郵　箱：[email protected] 郵　編：201800 地　址：上海市嘉定區(qū)翔江公路518號(hào)寅尚產(chǎn)業(yè)園D座210室 Copyright ? 2018 CHUANQIU Biotechnology Co.,Ltd. All Rights Reserved. 滬公網(wǎng)安備 31011402008568號(hào) 滬ICP備18030131號(hào)-1 申請(qǐng)?jiān)囉醚b 021-69950217