人伽馬干擾素定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ濃度。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

IFN-γ簡介：

被稱為II型干擾素的IFN-γ，是由143個殘基構(gòu)成的，有20和25kDa亞型的糖蛋白，以頭尾相連的同型糖蛋白的形式存在。

IFN-γ由T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，用以抗病毒和干擾增殖，此外，IFN-γ還有與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的幾種功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和程序性死亡，刺激或抑制不同基因的表達(dá)。

IFN-γ能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生吲哚胺2，3-雙加氧酶來抗弓形蟲和衣原體的感染。IFN-γ是效應(yīng)強(qiáng)烈的單核吞噬細(xì)胞增強(qiáng)劑，IFN-γ是通過增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞的Mac-1的表達(dá)來達(dá)到增強(qiáng)胞飲作用和吞噬作用的。IFN-γ通過增加巨噬細(xì)胞的氧自由基和TNF-α的釋放來達(dá)到增強(qiáng)殺腫瘤細(xì)胞的作用。IFN-γ選擇性地提高包括因LPS刺激的B細(xì)胞的IgG2a和因2型T細(xì)胞呈遞抗原而引起的B細(xì)胞的IgG3的釋放量。有報道稱IFN-γ能引起細(xì)胞的自分泌IFN-γ作用的增強(qiáng)。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IFN-γ的濃度。IFN-γ捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時，其中的IFN-γ會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人IFN-γ抗體后，抗人IFN-γ抗體與IFN-γ接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IFN-γ將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測，讀其450nm處的OD值，IFN-γ濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IFN-γ濃度。

人IFN-γ定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集，

D.若待測樣本不能及時檢測，標(biāo)本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：人血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準(zhǔn)備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使IFN-γ終濃度達(dá)到1000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個點，最高濃度為1000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度）

洗滌方法:

自動洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動洗板機(jī)；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標(biāo)準(zhǔn)品對照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清或血漿標(biāo)本，請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本, 如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素鏈接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人IFN-γ參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為1.8pg/ml。

2.特異性：與小鼠IFN-γ,大鼠IFN-γ,馬IFN-γ,狗IFN-γ,貓IFN-γ，豬IFN-γ等沒有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

1．Naylor, S.L., Sakaguchi, A.Y., Shows, T.B., et al.(1983) J.Exp.Med. 157:1020-1027

2．Wheelock, E. F.(1965) Science 146:310

3．Billiav, A.(1996) Adv. Immunol. 62:61

ELISA Kit for the Quantitative Analysis of Human IFN-γ

The human IFN-γ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit is used for detection of human IFN-γ in cell culture supernatants,human serum and plasma.THE ELISA KIT IS FOR RESEARCH USE ONLY. Please read this instruction manual carefully and check out the material provided before use, and you can contact with our company if any questions. You can enter our website or call us for other aim.

Introduction

IFN-γ, also called Type II interferon, is a 143 amino acid residue glycoprotein with MW of 20 or 25 kDa and exists as a head-to-tail homodimeric protein.Produced by T lymphocytes and natural killer (NK) cells, IFN-γ  induces an anti-viral or anti-proliferative state. In addition, IFN-γ  has several properties related to immunoregulation including cell proliferation and apoptosis, as well as the stimulation and repression of a variety of genes. IFN-γ can induces the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase, which is believed against Toxoplasma and Chlamydia . IFN-γ  is a potent activator of mononuclear phagocytes,  IFN-γ stimulates the ed the expression of Mac-1, augments endocytosis and phagocytosis by monocytes , and activates macrophages to kill tumor cells by releasing reactive oxygen intermediates and TNF-α. IFN-γ  selectively enhances both IgG2a secretion by LPS-stimulated B cells and IgG3 secretion in T cell independent type 2 antigen-mediated B cell activation. It has also been reported to induce its own expression..

Principles of the Test

The kits is a solid sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of human IFN-γ. An anti-human IFN-γ monoclonal antibody has been absorbed onto the wells of the microtiter strips provided. Samples including specimens or standards were pipetted into wells. The human IFN-γ in specimens or standards would be captured by the coated antibody and the free others were removed by washing. The human IFN-γ biotin-conjugated antibody were added and binds to human IFN-γ captured by the first antibody, which formed a sandwich. Streptavidin-HRP would be added and binds to the biotin conjugated antibody, then free Streptavidin-HRP would be removed during a wash step. After this, subtrate solution would be added and catalyzed by the HRP, and a coloured product is formed. The intensity of the colored product is used to calculate in proportion to the amount of human IFN-γ in the original specimen.

Materials provided with the kits: