人的白細(xì)胞介素23定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-23濃度。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

IL-23簡介：

白介23是通過二硫鍵連接IL-12的一個亞結(jié)構(gòu)P40和亞結(jié)構(gòu)P19蛋白形成的異源二聚體。IL-23的P19亞結(jié)構(gòu)與P40亞結(jié)構(gòu)都是屬于IL-6超家族的分泌蛋白。人的P19亞基由189個氨基酸的前體經(jīng)加工去掉19個亞基的信號肽后形成的，成熟的P19亞基由170個氨基酸。

雖然P19亞基由活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌，但只有活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞同時能表達(dá)P40亞基而形成有活性的IL-23。

IL-23與IL-12有類似與不同的生物活性。無論IL-23與IL-12都能誘導(dǎo)人的T細(xì)胞的增殖和 IFN-γ 的產(chǎn)生。小鼠的IL-23可強烈引起記憶性T細(xì)胞的增殖，但不能誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞的增殖，而IL-12對記憶性T細(xì)胞則沒有此效果。此外，IL-23能刺激記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-17，但I(xiàn)L-12則不能。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-23的濃度。IL-23捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時，其中的IL-23會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人IL-23抗體后，抗人IL-23抗體與IL-23接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-23將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測，讀其450nm處的OD值，IL-23濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IL-23濃度。

人IL-23定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測，

D.標(biāo)本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：人血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12 .血清和血漿標(biāo)本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準(zhǔn)備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X準(zhǔn)品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使IL-23終濃度達(dá)到2000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個點，最高濃度為2000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標(biāo)準(zhǔn)品對照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。對于血清或血漿標(biāo)本，請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本, 如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補充至100ul。   

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人IL-23參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為19.2pg/ml。

2.特異性：與人的IL-12，IL-12P35,IL-12p40dimer，il-12p40 monomer和小鼠的IL-23、IL-12、IL-12 p35等沒有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

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2. Langowski, J.L. et al. (2006) Nature 442:461.

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