人的金屬蛋白酶9定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的MMP-9濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

MMP-9簡介：

MMPs蛋白是一組具有鋅指結(jié)構(gòu)的鈣依賴的能夠降解胞間基質(zhì)成分的一組蛋白的統(tǒng)稱。MMP-9是該蛋白家族成員中的研究較多的一種，是一種明膠酶（明膠酶B）。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等。

結(jié)構(gòu)上，MMP-9的催化區(qū)包括3個重復的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9還有脯氨酸豐富的結(jié)構(gòu)域和含鋅指結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。

MMP-9是以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外，可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解， MMP-3可能是MMP-9最有效的激活劑。金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）作為MMP-9的抑制劑，與MMP-9的酶原或活化后酶的催化區(qū)的羧末端特異性結(jié)合，形成復合物。

MMP-9可由角化細胞、單核細胞、巨噬細胞和多形核白細胞等產(chǎn)生，在一些炎性反應的過程中常伴隨著MMP-9的產(chǎn)生。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中MMP-9 的濃度。MMP9 捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的MMP-9 會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人MMP-9 抗體后，抗人MMP-9 抗體與MMP-9 接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在MMP-9 將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，MMP-9 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中MMP-9 濃度。

人MMP-9定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D.標本收集后請分裝，若待測樣本不能及時檢測，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注：人血清或血漿樣本請用標準品稀釋液稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3. 將5×標準品稀釋液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水)。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入1X標準品稀釋液復溶使MMP-9終濃度達到2000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為2000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                    

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。如果是血清血漿樣本，不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在400~1500倍，如無明確范圍，建議從400倍稀釋，如果樣本濃度過高，超過檢測范圍，請加大稀釋倍數(shù)后重新稀釋檢測。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人MMP-9參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結(jié)果表明，最小檢出量為7.3pg/ml。

2.特異性：不與MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-13、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4等反應。

3.重復性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

1. Tamura, T. et al. (1996) Endocrinology 137:3729.

2. Okamoto, T. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:6059.

3. Cullen, B. et al. (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:241.

4. Maeda, A. and R.A. Sobel (1996) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55:300.

5. Ueda, Y. et al. (1996) Am. J. Pathol. 148:611.

6. Ito, A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:14657.