人骨硬化蛋白定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的SOST濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

SOST簡介：

硬骨素又名骨硬化蛋白，為“胱氨酸結(jié)”(cystine knot)結(jié)構(gòu)的分泌型糖蛋白，屬于Cerberus/DAN家族。

硬骨素是一種骨形成的負調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)骨重建過程中起著非常重要的作用，在骨骼、軟骨、腎臟和肝臟等器官中硬骨素的含量較高。

骨硬化蛋白的缺失會導(dǎo)致硬化性骨化病和Van Buchem's病等，通常表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松等病變。硬骨素有獨特的配體特異性，與BMP-5,6,7的親和性較高，與BMP-2,4的親和性較低。硬骨素能夠與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6相結(jié)合，從而拮抗Wnt通路

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中SOST的濃度。SOST捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當(dāng)加入標本或參考品時，其中的SOST會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人SOST抗體后，抗人SOST抗體與SOST接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在SOST將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，SOST濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中SOST濃度。

SOST定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注：人血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

浮物應(yīng)通過離心去除。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋備用。

4.標準品: 按標簽復(fù)溶體積加入標準品稀釋液復(fù)溶使SOST終濃度達到4000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴格控制在25～28℃，加入標準品稀釋液后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解（現(xiàn)溶現(xiàn)用），用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為4000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。如果是血清血漿樣本，需提前通過預(yù)實驗確定稀釋倍數(shù)，一般范圍在5~20倍，如無明確范圍，建議從2倍開始，加樣稀釋說明如下：每孔先加樣本分析緩沖液50ul，再加用1×標準品稀釋液稀釋后的樣本，加樣量為50ul。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

 人SOST參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：41.5pg/ml

2.特異性：與人的BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7不反應(yīng)，與小鼠的SOST蛋白有30%交叉反應(yīng)性。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

1. Gonzalez-Reimers, E. et al. (2013) Alcohol Alcohol. 48:278

2. Gonzalez-Reimers, E. et al. (2013) Alcohol Alcohol. 48:278

3. van Bezooijen, R.L. et al. (2009) J. Dent. Res. 88:569.

4. Kamiya, N. et al. (2012) Curr. Mol. Pharmacol. 5:153.

5. van Lierop, A.H. et al. (2012) J. Clin. Endocrinol. Metab. 97:E1953.

6. Winkler, D.G. et al. (2003) EMBO J. 22:6267.

7. Kamiya, N. et al. (2008) Development 135:3801