人的膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的GDNF濃度。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請(qǐng)?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

GDNF簡介：

膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF，是屬于TGF-β 超家族中的一個(gè)二硫鍵連接的同質(zhì)二聚體的糖蛋白。成熟的人GDNF是由211個(gè)氨基酸的前體蛋白裂解后形成的134個(gè)氨基酸的多肽以同質(zhì)二聚體形式組成。GDNF 在哺乳動(dòng)物中較保守，人和大鼠的序列有93%的同源性。

人GDNF是一個(gè)神經(jīng)營養(yǎng)因子，能刺激多種中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)的不同神經(jīng)細(xì)胞的生長，這些神經(jīng)元包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，間腦的多巴胺型神經(jīng)元，浦肯野氏細(xì)胞和交感神經(jīng)元細(xì)胞等。已知的能分泌GDNF的細(xì)胞包括支持細(xì)胞（賽托利細(xì)胞）、I型星形膠質(zhì)細(xì)胞，斯旺氏細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、松果體細(xì)胞以及骨骼肌細(xì)胞等。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中GDNF的濃度。GDNF捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的GDNF會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人GDNF抗體后，抗人GDNF抗體與GDNF接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在GDNF將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會(huì)催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測，讀其450nm處的OD值，GDNF濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中GDNF濃度。

人GDNF定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時(shí)檢測，

D.標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請(qǐng)勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：人血清或血漿樣本請(qǐng)用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒請(qǐng)保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請(qǐng)丟棄。

4.底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時(shí)建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測時(shí)，檢測抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長。

檢測前準(zhǔn)備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X準(zhǔn)品稀釋液，請(qǐng)按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使GDNF終濃度達(dá)到2000pg/ml，室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為2000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實(shí)驗(yàn)過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動(dòng)洗板機(jī)；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。對(duì)于血清或血漿標(biāo)本，請(qǐng)加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本, 如稀釋量大，請(qǐng)將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。   

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人 GDNF 參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為20.8pg/ml。

2.特異性：與人BDNF，β-NGF，NT-3， NT-4，CNTF等沒有交叉反應(yīng)。與大鼠GDNF有35%的交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

1. Anitha, M. Gondha, C. Sutliff, R. Parsadanian, A. Mwangi, S. Sitaraman, S. V. Srinivasan, S. GDNF rescues hypergly cemia- induced diabetic enteric

2. Boucher, T. J. Okuse, K. Bennett, D. L. H. Munson, J. B. Wood, J. N. McMahon, S. B. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states.

3. Gash, D. M. Zhang, Z. Ovadia, A. Cass, W. A. Yi, A. Simmerman, L. Russell, D. Martin, D. Lapchak, P. A. Collins, F. Hoffer, B. J. Gorhardt, G. A.

4. Schindelhauer D. et al., 1996, Genomics. 28 (3): 605-7.

5. Carnicella S. et al., 2008, Proc Natl Acad Sci . 105 (23): 8114-9.