人凝血因子III定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的凝血因子III濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

凝血因子III 簡介：

凝血因子III也被稱為組織因子、F3以及CD142，屬于組織因子家族的單通道I型膜蛋白，其大小約為47 kDa。凝血因子III由295氨基酸組成，包含了一個信號肽（1-32號殘基）和一個完整的肽鏈（33-295號殘基）。作為I型膜蛋白，它包含一個跨膜區(qū)域（252-274號殘基）和胞質(zhì)尾。

凝血因子III作為一種蛋白質(zhì)參與止血和炎癥過程。在血管損傷后，組織因子通過綁定并激活血漿絲氨酸蛋白酶（VIIa因子），激活凝血系統(tǒng)。此外，凝血因子III還能夠阻止細胞凋亡，增強腫瘤細胞系的生存能力。但是，凝血因子如何調(diào)控這些細胞過程尚未完全清楚。

凝血因子III在在血管的皮下細胞中持續(xù)表達，如血管平滑肌細胞。而對其它細胞，如內(nèi)皮細胞和單核細胞，當受到細胞因子和生長因子刺激時也能表達凝血因子III。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中凝血因子III的濃度。凝血因子III捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的凝血因子III會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人凝血因子III抗體后，抗人凝血因子III抗體與凝血因子III接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在凝血因子III將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，凝血因子III濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中凝血因子III濃度。

人凝血因子III定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:  

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注：血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使凝血因子III終濃度達到1000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為1000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清或血漿標本，請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標本, 如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100ul。   

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人凝血因子III參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結(jié)果表明，最小檢出量為4.5pg/ml。

2. 特異性：與人凝血因子VII 、,凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XIV，小鼠凝血因子III等沒有交叉反應。

3.重復性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻:

1. Camerer, E. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255.

2. Mueller, B.M. et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:1372.

3. Mackman, N. et al. (2006) Blood Cells Mol. Dis. 36:104.

4.. Bavendiek, U. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:25032.

5. Belting, M. et al. (2004) Nature Med. 10:502.

6. Levi, M. (2007) Crit. Care Med. 35:2191.

7. Carmeliet, P. et al. (1996) Nature 383:73.