人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的胱抑素C濃度。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投拆，請(qǐng)?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

胱抑素C簡(jiǎn)介：

半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，也稱為Cystatin-3(CST3)是一種真核細(xì)胞分泌的II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，屬于II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族。其分子量為13kDa，由120個(gè)氨基酸組成。

Cystatin C可抑制組織蛋白酶類，并通過(guò)抑制組織蛋白酶介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞入侵而起著腫瘤抑制因子的作用。此外，胞外實(shí)驗(yàn)證明，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C會(huì)抑制正常和腫瘤細(xì)胞的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C通過(guò)與TGF-β II型受體結(jié)合，抑制TGF-β蛋白的結(jié)合。

低分子量半胱氨酸蛋白酶抑制劑C蛋白近年來(lái)已經(jīng)取代肌酐成為腎功能的生物標(biāo)志物。

檢測(cè)原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中胱抑素C的濃度。胱抑素C捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的胱抑素C會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。當(dāng)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人胱抑素C抗體后，抗人胱抑素C抗體與胱抑素C接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在胱抑素C將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的OD值，胱抑素C濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中胱抑素C濃度。

人胱抑素C定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集若待測(cè)樣本不能及時(shí)檢測(cè)，

D.標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測(cè)前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過(guò)離心去除。

4.請(qǐng)勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測(cè)，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：樣本如需稀釋請(qǐng)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后再檢測(cè)。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒請(qǐng)保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請(qǐng)丟棄。

4.底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃。

9.洗滌過(guò)程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過(guò)程中避免氣泡的產(chǎn)生。

樣本的稀釋:

1. 血清或血漿樣本最少30倍稀釋

2.細(xì)胞上清及尿樣本稀釋倍數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定；

3.唾液樣本最少20倍稀釋；

4.乳汁樣本稀釋倍數(shù)從40倍開(kāi)始

5.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液如不夠，可用新生牛血清稀釋。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測(cè)后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.將5×標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液用去離子水或雙蒸水按1：4稀釋成所需的體積；

4.將檢測(cè)抗體用檢測(cè)抗體稀釋液按標(biāo)識(shí)提前10分鐘配制成工作濃度；

5.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶使使胱抑素C終濃度達(dá)到100ng/ml，室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為100ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）下圖為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋示意圖。

洗滌方法:

自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動(dòng)洗板機(jī)；                    

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過(guò)計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.分別將稀釋好的標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.每孔加入HRP抗體結(jié)合物工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7. 加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測(cè)量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測(cè)量值。

2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線

人胱抑素C參考標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。

靈敏度，特異性和重復(fù)性:

1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為1.8ng/ml。

2.特異性：與人的Cathepsin A，Cystatin A , Cystatin B等沒(méi)有反應(yīng)，與小鼠胱抑素C,小鼠胱抑素A, 小鼠胱抑素B等沒(méi)有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%.

參考文獻(xiàn):

1.Deng A, Irizarry MC, Nitsch RM, Growdon JH, Rebeck GW: Elevation of cystatin C in susceptible neurons in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 159: 1061-1068 (2001)

2. Tian S, Kusano E, Ohara T, Tabei K, Itoh Y, Kawai T, Asano Y: Cystatin C measurement and its practical use in patients with various renal diseases. Clin Nephrol. 48: 104-108 (1997)

3. Dharnidharka VR, Kwon C, Stevens G: Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function: a meta-analysis. Am J Kidney Dis. 40: 221-226 (2002)

4. Risch L, Blumberg A, Huber A: Rapid and accurate assessment of glomerular filtration rate in patients with renal transplants using serum cystatin C. Nephrol Dial Transplant. 14: 1991-1996 (1999)