種屬

人

細胞來源

上海市東方醫(yī)院

生長特性

貼壁 球形克隆

培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：STEMCELL的mTSR1，人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基

溫度：37℃     氣相：95%空氣,5% CO2

傳代

1.用75%酒精噴灑整個培養(yǎng)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進行1-3小時的緩沖，.然后置于無菌操作臺，打開瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基(以T25培養(yǎng)瓶為例)并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況及培養(yǎng)基顏色變化對其進行換液以及傳代，每次傳代48h后一天換一次；

2.待細胞克隆還沒開始融合時，需要對其進行傳代，傳代比例為1:4；

3傳代步驟：將1 mg/mL膠原酶IV消化液置于37°預熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入3-5 ml PBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加2 ml預熱好的膠原酶，置于37°孵育消化（第一次消化需時常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細胞脫落為最佳消化時間，記錄最佳消化時間，以便于下次消化，前30min觀察一次，之后每15min觀察一次）一般孵育30-60min左右，消化好后加入5ml完全培養(yǎng)基。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之完全脫落，然后收集細胞懸液，置于15ml離心管中，待細胞自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除，加入hES完全培養(yǎng)液5 ml，吹打2-3次，待細胞自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除。再加入培養(yǎng)液重懸細胞傳代。每次傳代后48h內(nèi)不要移動。

保存

凍存條件：60%完全培養(yǎng)基+30%FBS（ES級）+10%DMSO

(備注：建議使用本公司的冷凍液（H-W-100），用4度保存的冷凍液直接重懸細胞，不能預熱后使用。)

保存條件：液氮存儲

供應限制

僅供研究之用

常見問題及解決方案

1.培養(yǎng)瓶有破裂，培養(yǎng)液有漏液：細胞極大可能會污染，所以我們會及時安排幫老師解決。

2.細胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。1-2小時后觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以去掉，留8-10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細胞生長至匯合度80%，進行消化傳代；如細胞還是不貼壁，將細胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術人員會一直跟蹤指導，直到問題解決。