種屬

人

細(xì)胞來(lái)源

上海市東方醫(yī)院

生長(zhǎng)特性

貼壁 球形克隆

培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：STEMCELL的mTSR1，人胚胎干細(xì)胞無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基

溫度：37℃     氣相：95%空氣,5% CO2

傳代

1.用75%酒精噴灑整個(gè)培養(yǎng)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行1-3小時(shí)的緩沖，.然后置于無(wú)菌操作臺(tái)，打開(kāi)瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基(以T25培養(yǎng)瓶為例)并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液以及傳代，每次傳代48h后一天換一次；

2.待細(xì)胞克隆還沒(méi)開(kāi)始融合時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行傳代，傳代比例為1:4；

3傳代步驟：將1 mg/mL膠原酶IV消化液置于37°預(yù)熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入3-5 ml PBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加2 ml預(yù)熱好的膠原酶，置于37°孵育消化（第一次消化需時(shí)常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細(xì)胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見(jiàn)細(xì)胞脫落為最佳消化時(shí)間，記錄最佳消化時(shí)間，以便于下次消化，前30min觀察一次，之后每15min觀察一次）一般孵育30-60min左右，消化好后加入5ml完全培養(yǎng)基。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之完全脫落，然后收集細(xì)胞懸液，置于15ml離心管中，待細(xì)胞自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除，加入hES完全培養(yǎng)液5 ml，吹打2-3次，待細(xì)胞自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除。再加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞傳代。每次傳代后48h內(nèi)不要移動(dòng)。

保存

凍存條件：60%完全培養(yǎng)基+30%FBS（ES級(jí)）+10%DMSO

(備注：建議使用本公司的冷凍液（H-W-100），用4度保存的冷凍液直接重懸細(xì)胞，不能預(yù)熱后使用。)

保存條件：液氮存儲(chǔ)

供應(yīng)限制

僅供研究之用

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

1.培養(yǎng)瓶有破裂，培養(yǎng)液有漏液：細(xì)胞極大可能會(huì)污染，所以我們會(huì)及時(shí)安排幫老師解決。

2.細(xì)胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開(kāi)封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。1-2小時(shí)后觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以去掉，留8-10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%，進(jìn)行消化傳代；如細(xì)胞還是不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo)，直到問(wèn)題解決。